千葉工業大学　プロジェクト研究年報　2015年版

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また，マウスES細胞から得られた約６千万配列およびES細胞から神経細胞に分化する過程でのさまざまな段階の細胞から得られたそれぞれ約１千万配列についても解析を進めており，新規低分子RNAの候補を数個見出した． （２）低分子RNA候補の立体構造形成スクリーニング 多数の低分子RNA候補について，その立体構造形成を迅速に評価するための，NMR試料管内転写法を開発し，構造既知のRNAについて適用することによって，その有用性を実証した．本手法をINTT法（in NMR tube transcriptionに由来）と命名した（発表論文２，図）．この手法をプロジェクトで見出した低分子RNA候補に適用し，安定な立体構造を形成するRNAを探索している． （３）配列解析 マウスES細胞が神経細胞に分化する過程のさまざまな段階の細胞から低分子RNAを抽出し，配列解析を進めた． （４）マイクロアレイ解析 マウスゲノム上で全てのセンス—アンチセンス遺伝子座（SAT遺伝子鎖）においてエクソン同士の重なりを考慮して作製したマイクロアレイを用い、マウス脳由来の低分子RNAをターゲットとして配列解析を行った。現在、ノーザン解析での検証を行っている。 （５）ノーザン解析 次世代シーケンサーによる配列解析等によって見出した新規低分子RNA候補の発現量等を確認するため，マウスのさまざまな組織からRNAを抽出し，ノーザン解析を行い，３つのRNAについて強い発現，４つのRNAについて弱い発現を示す結果を得た．このうち，MsncR-4と命名したRNAについては得られているcDNA情報とノーザン解析の結果に矛盾があったため，さらなる解析を行った。その結果，このRNAはいくつかの臓器で30 nt程度の短い断片として存在することが示唆された． （６）転写単位の同定 non-RIによるプライマーエクステンション法を確立し，ノーザン解析でシグナルを得たRNAのうち4種類に対して5’末端の配列を決定するための実験を行った．残り3種類に関してはノーザン解析で得られたシグナルがかなり弱かったので解析対象から除外した．その結果，末端を特定できたものは1種類のみであった． （７）低分子RNAに対する結合因子や複合体の精製 新規低分子RNA候補のうち，ノーザン解析で発現が確認でき，その末端が決定できたものを対象として，複合体解析を行うことを計画したが，上述（５），（６）の通り，最終的な対象候補は1種類に絞られた．しかし，このRNAについては，後に反復配列由来のものであることが判明したため，これも解析の対象から除外した． なお，これらの結果を受けて当初計画を修正し，上述のMsncR-4およびそれに由来する可能性のある短いRNAについて，それぞれの生合成経路および機能を明らかにする方向での研究の展開を検討している． （８）立体構造解析 これまでに見出した新規RNA候補のひとつであるMsncR-11に着目し，立体構造解析を進めた．MsncR-11は，ミトコンドリアtRNA遺伝子の裏鎖に相当するRNAであり，ミトコンドリアmRNAのプロセシングに関与している可能性がある．NMR法による解析を行ったところ，MsncR-11は，tRNAのアクセプタステムとTステムに相当する二次構造を形成していることが示唆され，現在論文作成中である． ３．まとめ 以上のように本プロジェクトでは，当初の計画通りに，マウス細胞中から新規RNA候補を発見することに成功した．プロジェクトでは，2014年6月に千葉工業大学において公開シンポジウム「Structured ncRNA研究への前哨」を実施し，研究成果を紹介するとともに，今後の研究の展開について議論した．さらに，2014年11月の日本分子生物学会年会において，ワークショップ「機能性RNA分子研究の新展開」を実施し，これまでの成果を発表した． 本研究に関する主な発表論文 １．Kiyosawa, H., Okumura, A., Okui, S., Ushida, C., and Kawai, G., Secondary structure-based analysis of mouse brain small RNA sequences obtained by using next-generation sequencing, Genomics in press. doi: 10.1016/j.ygeno.2015.05.003 ２．Okui, S. and Kawai, G., In NMR tube transcription for rapid screening of RNA conformation, Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids 34, 103-113 (2015). doi: 10.1080/15257770.2014.964412 ホームページ http://www.le.it-chiba.ac.jp/kawai/mouserna2/index.html 2015　千葉工業大学附属研究所　プロジェクト研究年報　　　　　　　　　　Project Report of Research Institute of C.I.T 2015　　　　132

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