千葉工業大学　プロジェクト研究年報　2014年版

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因子である転写因子が類似していると不都合なので，積極的な変更が必要だと考えられる．どのように制御因子と被制御因子との関係が築かれるかを明らかにするためには，まだ見つかっていないオルニチンの代謝反応を制御する転写因子を発見する必要があると考え，探索を行った． （2）オルニチン代謝反応を制御する転写因子の探索 アルギニン代謝やリジン代謝反応を制御する転写因子との相同性検索から候補となる転写因子の探索を試みたが，候補となるものは見つからなかった． これまでの報告から，細胞外の環境が酸性条件下でオルニチン代謝反応が活発に働くとされているので，大腸菌の遺伝子発現データベース（NCBI，Gene Expression Omnibus）を利用して，酸性条件下で発現が上昇した遺伝子の中から，転写因子に分類されるものを探索した（図3）．その結果，酸性条件下で発現が上昇する，3つの候補遺伝子が見つかった．そのうちの2つは，すでに制御する対象遺伝子が報告されていたために候補から除外し，残るひとつの候補遺伝子について，機能解析による同定を試みた． （3）オルニチン代謝反応を制御する転写因子候補遺伝子のクローニング 大腸菌のゲノム配列データベースから，候補遺伝子の塩基配列を取得し，タンパク質発現系構築のためにプライマーを設計し，PCRによる遺伝子増幅を試みた． その結果，候補遺伝子配列を含むと予想されたサイズのDNA断片の増幅に成功した．塩基配列を確認するために，ベクターへの組込みを試みたが，得られたベクターはいずれも目的のDNA断片を含まなかった．ベクターを変えて，TAクローニングや脱リン酸化処理を伴うライゲーション反応など試みているが，目的のDNA断片をもつベクターの構築にはまだ成功しておらず，検討中である． ３．まとめ 3種の塩基性アミノ酸代謝反応に関わるタンパク質のうち，オルニチン代謝に関わる転写因子だけが見つかっていない．関連タンパク質の分子系統解析の結果から，オルニチン代謝に関わるタンパク質が他の2種よりも先に分かれていることと，遺伝子構造の差異との間に関係があると予想される．今後は，オルニチン代謝を制御する転写因子とその認識配列の同定をおこない，他の2種と比較することで，環境ストレスに対する遺伝子発現制御機構の進化について明らかにしたい． 参考文献 (1) Y. Fang etal. A Bacterial arginine-agmatine exchange transporter involved in acid resistance, J. Biol.Chem. (2007) 282, 176-182. (2) X. Gao etal. Mechanism of substrate recognition and transport by an amino acid anti-porter, Nature (2011) 463, 828-832. 図１．アルギニン代謝反応と遺伝子構造．図中の囲いは大腸菌の細胞を示す．細胞外の塩基性アミノ酸アルギニンは，トランスポーターAdiCによって細胞内に取込まれ，脱炭酸酵素AdiAによってアグマチンとなる．アグマチンは，AdiCによって細胞外に排出される．代謝反応に関わる酵素の遺伝子は，大腸菌ゲノム上に並んでおり，adiA遺伝子の上流配列に転写因子AdiYが結合して遺伝子の発現を制御する． 図2．脱炭酸酵素とトランスポーターの分子系統樹．括弧内の3種の塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸の代謝反応に関わるタンパク質のアミノ酸配列を用いて作成した． 図3. 候補遺伝子の細胞外pH変化による遺伝子発現プロファイル．グラフ中のバーが大きいほど，遺伝子発現量が多いことを示す．酸性側で発現量の上昇傾向が見られた． 2014　千葉工業大学附属総合研究所　プロジェクト研究年報　　　　　　　　　　Project Report of Research Institute of C.I.T 2014　　　　　　20

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